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目錄：

一、紫外可見分光光度計簡介

二、紫外可見分光光度計的分類（按儀器結構分類）

三、紫外可見分光光度計工作原理

四、紫外可見分光光度計在生命科學中的應用

五、紫外可見分光光度計在計量領域中的應用

六、紫外可見分光光度計特點（尤尼柯）

七、紫外可見分光光度計技術參數（尤尼柯）

八、紫外可見分光光度計中的單色器結構

九、紫外可見分光光度計的使用方法

十、紫外可見分光光度計使用注意事項

十一、紫外可見分光光度計故障解決方法 

十二、紫外可見分光光度計其他使用說明

十三、紫外可見分光光度計避免分析誤差說明

十四、紫外可見分光光度計選購指南

十五、紫外可見分光光度計與紫外分光光度計的區別

 

為了方便廣大用戶能更方便的了解紫外可見分光光度計知識，上海巴玖技術人員為用戶們整理了紫外可見分光光度計的常見問題，希望以下信息能夠對您有所幫助。

一、紫外可見分光光度計簡介

紫外可見分光光度計是分析行業不可缺少的儀器之一，它在科技領域的作用是非常之大的，主要是用來做定量分析、純度分析、參與結構分析（結構簡單的樣品可直接作結構分析）、參與定性分析（結構簡單的樣品可直接作定性分析）；特別是在定量分析和純度檢查方面。紫外可見分光光度計可廣泛應用于生命科學、食品科學、農業科學、醫療衛生、化學化工等多個領域。

二、紫外可見分光光度計的分類（按儀器結構分類）

1.單光束紫外可見分光光度計

單光束紫外可見分光光度計是世界上紫外可見分光光度計，單光束紫外可見分光光度計只有一束單色光，一只比色皿，一只光電轉換器( 又稱光接收器)。其光電轉換器通常采用硅光電池、光敏三極管或光電管，其結構簡單、價格[cheapest，但因其雜散光、光源波動、電子學的噪聲等都不能抵消，故單光束紫外可見分光光度計的光度[accuracy]度差。

2.雙波長紫外可見分光光度計

①.雙波長紫外可見分光光度計都采用兩個單色器。光源發出的光被兩個單色器分別分離出波長為λ1 和λ2 ，通過斬波器將兩束單色光λ1 和λ2 交替入射到同一試樣中，光電倍增管交替地接收到經過試樣吸收后的這兩束單色光，并把它們變成電信號。

②.此類光度計主要適用于求出試樣中待測組分的含量或濃度。如果試樣中有共存干擾吸收物質, 則可采用等吸收點法和系數倍率法測量。如果試樣的吸收光譜上，有兩個或兩個以上組分的吸收峰互相重疊或非常接近，或者有很大的渾濁背景吸收干擾，則可利用導數光譜來分析測試。以上是根據光束、比色皿、光電轉換器的數量來分類的，也有人根據光接收器的類型，把紫外可見分光光度計分為光電二極管陣列多通道紫外可見分光光度計、CCD ( 電荷耦合光接收器) 多通道紫外可見分光光度計等。

3.雙光束紫外可見分光光度計

雙光束紫外可見分光光度計是有兩束單色光的紫外可見分光光度計。它有兩種類型：一種是兩束單色光，兩只比色皿，兩只光電轉換器；另一種是兩束單色光，兩只比色皿，一只光電轉換器。目前，國內外的雙光束紫外可見分光光度計中，兩只光電轉換器的雙光束紫外可見分光光度計儀器已很少見，絕大多數或基本上都是一只光電轉換器的儀器，特別是高檔雙光束紫外可見分光光度計，都是一只光電轉換器的儀器。這兩種類型的雙光束紫外可見分光光度計所用的光電轉換器基本上全部是光電倍增管( PMT )。

4.準雙光束紫外可見分光光度計

所謂準雙光束紫外可見分光光度計就是有兩束光，但只有一只比色皿的紫外可見分光光度計。其中，一束光通過比色皿，另一束光不通過比色皿。不通過比色皿的那束光主要起抵消光源波動對分析誤差影響的作用。準雙光束紫外可見分光光度計有兩種類型：一種是兩束單色光， 一只比色皿，兩只光電轉換器；另一種是一束單色光，一束復合光，一只比色皿，兩只光電轉換器。

三、紫外可見分光光度計工作原理

紫外可見分光光度計工作原理是利用一定頻率的紫外--可見光照射被分析的有機物質，引起分子中價電子的躍遷，它將有選擇地被吸收。一組吸收隨波長而變化的光譜，反映了試樣的特征。在紫外可見光的范圍內，對于一個特定的波長，吸收的程度正比于試樣中該成分的濃度，因此測量光譜可以進行定性分析，而且根據吸收與已知濃度的標樣的比較，還能進行定量分析。

四、紫外可見分光光度計在生命科學中的應用

1.糖類分析測試工作中的應用

紫外可見分光光度計在糖的分析中，主要是作定量檢測。因為糖對紫外光的主要吸收波長為218nm，所以，對糖類進行分析時，只要采用光度測量模式，將紫外可見分光光度計儀器的波長GOTO到氨基酸的髙至吸收峰218 nm上，就可測試其吸光度大小，從而計算出糖的含量。

2.多糖分析測試工作中的應用

紫外可見分光光度計在多糖的分析中，主要也是作定量檢測。因為多糖對紫外光的主要吸收波長為206nm，所以我們只要采用光度測量模式，將紫外可見分光光度計儀器的波長GOTO 到多糖的髙至吸收峰206 nm 上，就可測試其吸光度大小，從而計算出多糖的含量。

3.核酸分析工作中的應用

紫外可見分光光度計在核酸分析中的應用，主要是用來對核酸的定量檢測；因為核酸的吸收峰在260nm。我們只要采用光度測量模式，將紫外可見分光光度計的波長GOTO 到核酸的髙至吸收峰260nm 上，測試其吸光度大小就是了。

4.蛋白質分析工作中的應用

紫外可見分光光度計在蛋白質的分析中，[much]主要的是作蛋白質含量檢測；一般是在蛋白質的吸收峰上作吸光度測定。因為蛋白質對紫外光的主要吸收波長為280nm，所以，采用光度測量模式，將儀器的波長GOTO 到蛋白質的髙至吸收峰波長280nm 上，測試其吸光度大小，就可完成對蛋白質的定量檢測。

5 氨基酸分析工作中的應用

紫外可見分光光度計在氨基酸分析中的應用，主要是用來對氨基酸的定量檢測。因為氨基酸對紫外光的主要吸收波長為230nm，所以，我們只要采用光度測量模式，將紫外可見分光光度計儀器的波長GOTO 到氨基酸的髙至吸收峰230nm 上，就可測試其吸光度大小，從而計算出氨基酸的含量。但是，因為氨基酸分析時，一般是將它溶解在水中，而水在230 nm 附近有很多干擾吸收線，所以，在用紫外可見分光光度計對氨基酸分析檢測時，要注意防止干擾的問題。此外，還需注意：只有少數氨基酸有紫外吸收，多數氨基酸無紫外吸收或很弱，測定時要衍生化后再測。

五、紫外可見分光光度計在計量領域中的應用

1.光度[accuracy]度檢測標準片的測試

我國質量技術監督局所屬的計量測試單位，對許多有關企業在用的紫外可見分光光度計的光度[accuracy]度的檢測，一般都是采用標準片( 如中性灰片或某些有特殊吸收峰的透紫石英片) 來進行的。總是在一臺光度[accuracy]度比被檢測儀器要高2～3 倍的儀器上對標準片進行標定， 而后用這些標定過的標準片對被檢測的紫外可見分光光度計的光度[accuracy]度進行檢測。再根據檢測的數據, 作出被檢儀器是否合格的判斷。

2.光度[accuracy]度檢測標準液的測試

我國質量技術監督局所屬的計量測試單位，對許多有關企業在用的紫外可見分光光度計的光度[accuracy]度的檢測，有時采用標準液(如重鉻酸鉀等) 來進行。用一臺光度[accuracy]度比被檢測儀器的光度[accuracy]度要高2～3 倍的紫外可見分光光度計。對標準液進行標定，而后用這些標定過的標準液，來對被檢測的紫外可見分光光度計的光度[accuracy]度進行檢測。再根據檢測的數據，作出被檢儀器是否合格的判斷。

3.雜散光檢測用的標準液的測試

我國質量技術監督局的計量測試單位，對許多有關企業在用的紫外可見分光光度計的雜散光的檢測，有時采用標準液( 如NaI、NaNO2 等) 來進行。用一臺光度[accuracy]度比被檢測儀器的光度[accuracy]度要高2～3 倍的紫外可見分光光度計，對標準液進行標定，找出檢驗測試點的位置，而后用這些標定過的標準液對被檢測的紫外可見分光光度計的雜散光進行檢測。再根據檢測的數據, 作出被檢儀器是否合格的判斷。

4.雜散光測試的標準片的測試

有時采用標準片(將NaI、NaNO2 固化在石英片基中) 來測試紫外可見分光光度計的雜散光。用一臺雜散光比被檢測儀器要高2～3 倍的紫外可見分光光度計，對標準片進行標定找出檢驗測試點的位置，而后用這些標定過的標準片，對被檢測的紫外可見分光光度計的雜散光進行檢測。再根據檢測的數據作出被檢儀器是否合格的判斷。

六、紫外可見分光光度計特點（尤尼柯）

1.采用低雜散光，高分辨率的單光束單色器，波長范圍200-1000nm

2.采用[much]新微機處理技術，自動調0%T和100%T。

3.儀器具有已知標樣濃度法及已知標樣系數法測定未知樣品濃度功能。

4.儀器配有標準的RS-232雙向通訊接口，可外接打印機。

5.儀器可配可在視窗（WINDOWS98，ME，XP）操作平臺上運行UNICO應用軟件。

6.寬大的樣品槽，可容納100mm光徑吸收池。

七、紫外可見分光光度計技術參數（尤尼柯）

1.波長范圍（nm）: 200-1000nm

2.波長精度（nm）： ±2.0nm

3.光譜帶寬(nm)：4nm

4.光度精度：±0.3%T

5.雜散光：≤0.2%T 在220nm和360nm處

6.穩定性： ±0.003A/h,在500nm處

7.光學系統：單光束，1200條/毫米衍射光柵

8.波長重復性：±1.0nm

9.光度重復性：0.2%T

八、紫外可見分光光度計中的單色器結構

1.光柵單色器

①.立特洛( Litt row) 型光柵單色器

光束在光柵上的入射角接近等于衍射角, 準直物鏡和成像物鏡同用一個物鏡。這種類型的單色器, 又稱自準式光柵單色器。因為它的入射狹縫、出射狹縫很靠近, 所以其雜散光比較大。

②.切爾尼-特納( Czerny-Turner ,簡稱C-T 型) 型光柵單色器

這種光柵單色器是一種采用兩塊球面鏡作為準直鏡和成像物鏡的系統。常用水平排列方式。兩塊球面鏡可相互補償慧差, 具有較好的成像質量。并且,增加狹縫高度不會嚴重影響儀器的分辨率。同時, 球面鏡的加工也比較容易。

在該系統中, 入射狹縫S1 和出射狹縫S2 對稱分布在色散元件的兩邊, M1 和M2 分別為準直鏡和物鏡; 該系統的髙至特點是像差(慧差) 小。它的慧差為自準直系統的1/ 5 左右, 所以該系統經常被大量采用。

③.瀨谷-波岡型凹面光柵單色器

=瀨谷-波岡型凹面光柵單色器是一種羅蘭圓外的裝置, 入射和出射狹縫都在羅蘭圓之外, 光柵上的入射光軸與出射光軸夾角較大, 一般約為i +θ= 70°。在保持入射狹縫和出射狹縫都不動的情況下, 繞光柵中心轉動光柵, 就可完成光譜掃描。一般入射角由26°變為44°時, 離焦量才有光柵中心到出射狹縫距離的0. 1%。其主要像差是像散和慧差。但已有消像散的凹面光柵, 可消除型光柵單色器像散, 獲得很高的像質。

④.艾伯特( Eber t ) 型光柵單色器

艾伯特( Eber t ) 型光柵單色器是只用一塊凹面球面鏡的兩部分, 作為準直鏡和物鏡, 代替C- T 型光柵單色器的兩塊凹面球面鏡。

2.棱鏡單色器

①.透射式棱鏡單色器

透射式棱鏡單色器一般采用阿貝型恒偏向棱鏡。直角棱鏡只起反光作用，不參與分光。所以, 阿貝棱鏡可以看成是兩塊30°的色散棱鏡, 它與一塊60°的分光棱鏡的作用相等效。

②.反射式立特洛( Litt row) 型棱鏡單色器

反射式立特洛( Litt row) 型棱鏡單色器的光路圖如圖3-21 所示。該單色器一般是用一塊離軸拋物面鏡同時起準直物鏡和成像物鏡的作用。光束兩次通過棱鏡, 可以使色散加倍。

③.自準式30°棱鏡單色器

在分辨率要求不高的時候，經常采用一塊球面鏡和一塊30°棱鏡組成簡單的立特洛型棱鏡單色器。其光路如圖3-22 所示。該單色器在棱鏡直角邊的一側涂上反射膜層，使光束經此面折回。當旋轉自準棱鏡時，可實現波長掃描。為減少雜散光，一般在棱鏡膜層后面或不通光的棱邊上涂上黑色無光漆。

④.瓦茨沃斯(Wadswor th) 型棱鏡單色器

該單色器的色散棱鏡和一塊平面反射鏡連在一起，形成恒偏向裝置。波長掃描時，棱鏡和平面鏡一起繞棱鏡底邊中點C轉。該系統有較好的成像質量。

3.單色器光路的排列和分類

①.水平式自準直系統

所謂自準直系統就是非對稱的單色器光學系統；所謂水平式自準直系統就是所有的光學元件中心和狹縫中心都在同一平面上的自準直系統。于球面反射鏡或拋物面反射鏡M1 的焦面上。當光線進入狹縫S1 后，通過小平面反射鏡射到M1 上， M1 將入射的光線變成平行光后,照射到光柵G上，經光柵色散后的光線再射到M1 上;還是由M1 聚焦到出射狹縫S2 上， 并在S2 處形成光譜。

②.垂直式自準直系統

垂直式自準直系統中，雜散光與球差的數量與水平式自準直系統相同。但慧差不同，水平式自準直系統的慧差使譜線產生非對稱性變寬，而垂直式自準直系統使譜線在高度方向產生非對稱性伸長。因此，對同樣的光學參數來說，該系統的分辨率略優于前者。

紫外可見分光光度計的使用方法

4.用于非平行光束的平面光柵單色器

常見的平面光柵單色器是把光柵放在平行光束中工作，這樣可使光柵產生的像差較小，儀器可以獲得較高的分辨率。但是，在有些專門的用途中，不要求分辨率很高，而要求儀器的通光性能很好。甚至通光性能比分辨率更加重要，這時可以將光柵放在非平行光束中，整個光學系統中除光柵以外,只有一塊凹面反射鏡

5. 雙單色器

單雙色器是將兩個簡單的單色器連接在一起就組成了雙單色器。雙單色器有一個入射狹縫、一個出射狹縫和一個中間狹縫。中間狹縫既是單色器的出射狹縫，又是第二個單色器的入射狹縫。

九、紫外可見分光光度計的使用方法

1.首先連接儀器電源線，確保儀器供電電源有良好的接地性能。

2.接通電源至儀器自檢完畢，顯示器顯示“546mm，100.0”即可進行測試。

3.用（MODE）鍵設置測試方式：透射比（T），吸光度（A),已知標準樣品濃度值方式（C）和已知樣品斜率（F）。

4.用波長設置鍵，設置所需要的分析波長，當波長改變時，排顯示器會顯示BLA字樣，提示下步必須調OA/100%T，當設置完分析波長后，如沒有調OA/100%T，儀器將不會繼續工作。

5.根據設置后的分析波長，再選擇正確的電源，光源的切換位置在335nm處，正常情況下，儀器開機后，鎢燈和氘燈同時點亮。

6.將參比樣品溶液和被測樣品溶液分別倒入比色皿中，打開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋，比色皿透光部分表面不能有指印、溶液痕跡，被測溶液中不能有氣泡，懸浮物。

7.將參比樣品推入光路中，按OA/100%T鍵調OA/100%T，此時顯示器顯示的“BLA--- ---”

直至顯示“100.0”或“0.000”為止。

8.[much]后當儀器顯示器顯示出“100.0”或“0.000”后，將被測樣品推“拉”入光路，這時便可從顯示器得到被測樣品的透射比或吸光度值。

十、紫外可見分光光度計使用注意事項

1.在使用過程中，如需開啟試樣室蓋時或暫時停止測試時，必須及時推入光門鈕桿（使光電管前光門關閉），保護光電管，以防止光電管受強光或長時間照射而損壞。

2.取吸收池時，應拿毛玻璃兩面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。另外使用完后應及時用測定溶劑沖凈，再用純化水沖凈，用干凈綢布或擦鏡紙擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防塵保存。

3.吸收池應選擇配對，否則要引入測定誤差。在規定波長下兩個吸收池的透光率相差小于0.5％的吸收池作配對。

4.在規定的吸收峰波長±2nm以內測試幾個點的吸收度，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確，除另有規定外，吸收峰波長應在該品種項下規定的波長±2nm以內。

5.在測定時或改測其它檢品時，應用待測溶液沖洗吸收池3～4次，用干凈綢布或擦鏡紙擦凈吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨損）。測定時，除另有規定外，應以配制供試品溶液的同瓶溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池。

6.空白溶液與供試品溶液必須澄清，不得有渾濁。如有渾濁，應預先過濾，并棄去初濾液。

7.一般供試品溶液的吸收度讀數，以在0.3～0.7之間的誤差較小。

8.由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸收度后應減去空白讀數，再計算含量。

十一、紫外可見分光光度計故障解決方法 

十二、紫外可見分光光度計其他使用說明

（一）紫外可見分光光度計光度測量

1.在模式選擇屏幕中選擇＜1. Photometric光度＞選項，將顯示參數配置屏幕。 

2.用GOTOWL鍵設定測量波長。

3.按F2鍵設定進樣控制。

4.按START/STOP鍵時，測量開始，顯示測量屏幕。

5.如需做空白校正，應在測量前先設置空白樣品，然后按AUTOZERO鍵，將測量值置為0ABS（100%）。

（二）紫外可見分光光度計校正

1.開機預熱10分鐘足矣。

2.放入黑塊和標樣（沒有的自己配），關閉蓋子。

3.校0：a把燈光對著黑塊，把透光度調0，b把燈光對標樣，將吸光度調到100%。

（三）參比溶液介紹

參比溶液又稱空白溶液。測量時用作比較的、不含被測物質但其基體盡可能與試樣溶液相似的溶液。通常，用參比溶液掃描的曲線應是一條平坦的直線。有時，基體中雖不含被測物質，但含有別的物質，這時必須保證其不影響測試。經常碰到的是試劑空白中含有被測物質，此時必須經過純化將其除去。否則將影響測定結果。

十三、紫外可見分光光度計避免分析誤差說明

1.紫外可見分光光度計出現誤差因素

1.雜散光是影響紫外可見分光光度計誤差的主要因素，它直接限制被分析測試樣品濃度的上限。當一臺紫外可見分光光度計的雜散光一定時，被分析的試樣濃度越大，其分析誤差就越大。ASTM 認為：“雜散光可能是光譜測量中主要誤差的來源。尤其對高濃度的分析測試時，雜散光更加重要”

2.雜散光的來源

① 灰塵沾污光學元件( 如光柵、棱鏡、透鏡、反射鏡、濾光片等)。

② 光學元件被損傷, 或光學元件產生的其他缺陷( 如光柵、透鏡、反射鏡、棱鏡材料中的氣泡等)。

③ 準直系統內部或有關隔板邊緣的反射。

④ 光學系統屏蔽不好。

⑤ 熱輻射或熒光引起的二次電子發射。

⑥ 狹縫的缺陷。

⑦ 光束孔徑不匹配。

⑧ 光學系統的像差。

⑨ 單色器內壁黑化處理不當。

3.雜散光的測試方法

目前，測試雜散光[much]常用的方法是所謂“ 截止濾光法” ( T he Cut Off FilterMethod) 或稱作“ 濾光片法” ( The Filte r Method) 。主要是采用濾光片或濾光液來測試紫外可見分光光度計的雜散光。有時也采用He-Ne 激光器的632. 8nm 來測試雜散光。具體做法是在離632. 8nm±5nm 處進行測試，測出的數值與632. 8nm 相比就是雜散光。“截止濾光法” 的具體測試方法：儀器冷態開機，預熱0. 5h，如用“濾光片法” 測試，則參比為空氣；如用濾光液來測試，則參比為溶劑(若用NaI、NaNO2 水溶液，則參比為蒸餾水)。設置儀器的縱坐標為% T，橫坐標為波長 nm) ，用濾光液時，試樣比色皿中裝濾光液，參比比色皿中裝溶解液，將波長調到相應的波長上( NaI 為220nm、NaNO2 為340nm) 進行測試。

十四、紫外可見分光光度計選購指南

1.考慮分光光度計的光譜：其是一個重要的考慮因素，如需要更大的靈活性，建議選擇一種更高性能的寬光譜儀器，可程序性地進行ELISAs分析和比色分析。

2.穩定性：它是用戶[much]關注的指標之一。儀器的宗旨就是穩定可靠，不穩定更談不上可靠了。

3.光譜帶寬：指從單色器射出的單色光譜線強度輪廓曲線的1/2高度處的譜帶寬度。表征儀器的光譜分辨率。按照比耳定律，光譜帶寬應該是越小越好的，但是如果儀器的光源能量弱，光學傳感器的靈敏度低時，光譜帶寬小了，也得不到理想的測量結果的。所以，選擇和使用儀器時一定注意。

4.噪聲：也是儀器的重要指標之一。它表征儀器的做稀溶液的能力。此指標也是越小越好。

5.波長的[accuracy]度和重復性：儀器的每個值都是在一定的波長下測得的，如果所示的波長和實際波長偏差萬里，那么測出的值和真值的吻合度從何談起呢？此指標也是非常重要的。

十五、紫外可見分光光度計與紫外分光光度計的區別

1.紫外可見分光光度計測量的范圍較大，由于各種不同光波發射的燈管不同，紫外分光光度計和紫外可見分光光度計就有所不同。

2.一般紫外分光光度計量程200nm->500~600nm間（包括部分可見光），

3.紫外可見分光光度計在340nm~1000nm，紫外可見分光光度計可調節200nm~1000nm。

4.同一種方法用不同的儀器去檢測誤差是很大的，幾乎可達到5%。如用同一種儀器在不同空間和時間下測量的數據誤差也能達到1%，但測量后經過各自的空白校正，相信誤差便不會超過1%，所以用不同的儀器測量數據整理后都是可以通用的，但沒有經過空白校正的數據不能互相代替。

注意：用紫外分光時一定要用石英比色皿，不可用玻璃比色皿，因紫外線很難透過玻璃。

《紫外可見分光光度計各類常規問題匯總》由上海巴玖整理，轉截請說明。